تاثیر مورفولوژی و اندازه ذرات ZnO بر عملکرد آنتی‌باکتریال
بررسی سنتز، مورفولوژی و اندازه ذرات ZnO
در این مطالعه، نانوذرات ZnO (ZnO NPs) پلی‌کریستال و مونودیسپرس و نانومیله‌ها (ZnO NRs) با استفاده از روش سل- ژل بدون سورفکتانت سنتز شدند. بر اساس شکل (a1)، نانوذرات دارای شکل کروی کامل و توزیع اندازه ذرات ZnO، یکنواخت با میانگین اندازه ذرات تقریبا 7 نانومتر است. با تغییر پارامترهای سنتز، مطابق شکل (b1و c1)، نانوذرات ZnO(غلظت عامل پیرسازی، زمان سنتز و دما)، نانومیله‌ها و ذرات ZnO، به‌دست آمدند.
میانگین اندازه نانومیله‌های ZnO تقریبا 5 × 17 نانومتر (عرض × طول) است. پس از آنیل نانوذرات ZnO در دمای 900 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت، نانوذرات ZnO با اندازه‌های 150 نانومتر به دست آمد. برای به دست آوردن ZnO با ساختار تکرارشونده (ZnO HSs) از واکنش سولوترمال استفاده شده است. تصویر SEM در شکل (d1) تشکیل ساختار گل‌مانند ZnO را تایید کرد. همه ذرات منفرد دارای شکل کروی و پلی‌کریستال با اندازه‌های تقریبا 4 میکرومتر هستند. همچنین ذرات ZnO چهارشاخه (ZnO TPs)، با استفاده از روش تبخیر حرارتی در هوا به‌دست آمده است. مطابق شکل (e1)، در این ذرات، چهارشاخه به یک هسته مرکزی متصل است. شاخه‌ها مورفولوژی شش‌ضلعی با طول حدود 2/5 میکرومتر و ضخامت تقریبا 170 نانومتر را دارا هستد.
تصاویر SEM و TEM اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو و میکرو (a) نانوذرات (b) نانومیله‌ها (c) ذرات (d) ساختار تکرارشونده (e) چهارشاخه‌ها.
خواص آنتی‌باکتریال اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو و میکرو
مطابق شکل زیر، فعالیت آنتی‌باکتریال اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو و میکرو در برابر سویه‌های باکتری گرم منفی اشریشیاکلی و اورئوس گرم مثبت با استفاده از اندازه‌گیری چگالی نوری پس از 24 ساعت دوره نهفتگی، بررسی شد. اندازه‌گیری OD عمدتا به‌عنوان یک روش سریع و مقرون‌به‌صرفه برای نظارت بر رشد باکتری‌ها در طی کشت آن‌ها در محیط مایع استفاده می‌شود.
هر چه تعداد باکتری‌ها در محلول بیشتر باشد، مقدار OD570 بیشتر می‌شود و درنتیجه فعالیت آنتی‌باکتریال نانوذرات و میکروذرات ZnO کمتر می‌شود. با اندازه‌گیری چگالی نوری در 570 نانومتر (OD570 ) می‌توان رشد باکتری‌ها را بر اساس تیرگی ناشی از پراکندگی نور تعیین کرد. برای همه نمونه‌ها، تعداد باکتری‌ها با افزایش غلظت ذرات ZnO کاهش یافت.
مؤثرترین سویه‌های باکتری اشریشیاکلی، نانوذرات و نانومیله‌های ZnO و همچنین ساختارهای تکرارشونده ZnO در بالاترین غلظت بودند و کمترین اثر آنتی‌باکتریال برای ذرات و چهارشاخههای ZnO مشاهده شد. این امر می‌تواند مربوط به مساحت سطح ویژه باشد که بیشترین مقدار به ساختارهای ناهمگن سه بعدی نسبت داده می‌شود. همچنین می‌تواند متاثر از نسبت حجم به سطح ویژه باشد که اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو و نانومیله‌ها بیشترین فعالیت آنتی‌باکتریال را ایجاد می‌کنند. کمترین سطح ویژه ZnO Ps و TPs منجر به کاهش فعالیت آنتی‌باکتریال شد. حتی در بالاترین غلظت (1 میلی گرم در میلی لیتر)، زنده ماندن آن‌ها به ترتیب به حدود 62% و 76% رسید.
سویه‌های باکتری گرم مثبت اورئوس، به عملکرد آنتی‌باکتریال نانوذرات ZnO حساس‌تر بودند. با این حال، در اینجا نیز، بیشترین کاهش تعداد باکتری‌ها پس از دوره نهفتگی با ZnO NPs، NRs و HSs، با بالاترین سطح ویژه قابل مشاهده بود.
(a) فعالیت آنتی‌باکتریال اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو و میکرو در برابر باکتری اشریشیاکلی. ستاره نشان‌دهنده تفاوت آماری معنی‌دار در مقایسه با نمونه‌های شاهد 0001/0≥ρ**، 001/0≥ρ* است. (b) باکتری اورئوس. ستاره نشان‌دهنده تفاوت آماری معنی‌دار در مقایسه با نمونه‌های شاهد 05/0≥ρ*، 01/0≥ρ**، 001/0≥ρ*** است. اندازه‌گیری چگالی نوری در 570 نانومتر پس از نهفتگی در دمای 37 درجه سانتیگراد، 220 دور در دقیقه به مدت 24 ساعت ارزیابی شد.
OD570 متناسب با تعداد کل باکتری‌ها است، اما هیچ اطلاعاتی در مورد زنده ماندن آن‌ها ارائه نمی‌دهد. بنابراین، علاوه‌بر‌این، رنگ‌آمیزی LIVE/DEAD BacLight با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال برای شناسایی باکتری‌های زنده و مرده استفاده شد. SYTO 9، رنگ سبز نشان‌دهنده سلول‌های زنده و پروپیدیوم یدید (PI) رنگ قرمز، بیانگر سلول‌های مرده‌ای است که یکپارچگی غشاء را از دست داده‌اند.
مطابق شکل زیر، نهفتگی هم‌زمان سلول‌های اشریشیاکلی با نانوذرات و میکروذرات ZnO به‌مدت 2 ساعت، برای تأثیرگذاری بر زنده ماندن باکتری‌ها کافی بود. در همه موارد، تعداد سلول‌های باکتری کاهش یافت و سیگنال‌های قرمز نشان‌دهنده سلول‌های مرده ظاهر شد. بر اساس شمارش هر دو سیگنال، می‌توان نتیجه گرفت که ZnO NRs و ZnO HSs با تعداد سلول‌های مرده بالای 50 درصد، بیشترین تأثیر را بر باکتری اشریشیاکلی داشتند. مطابق اندازه‌گیری‌های چگالی، در اینجا نیز کمترین اثربخشی مربوط به ZnO Ps و TPs بوده است.
اثر آنتی‌باکتریال به نسبت سطح به حجم ویژه مواد ZnO وابسته است و اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو در مقایسه با میکروذرات، فعالیت آنتی‌باکتریال بیشتری از خود نشان می‌دهند. تفاوت در فعالیت آنتی‌باکتریال ذرات ZnO بسته به اندازه و شکل آن‌ها می‌تواند به مکانیسم عمل متمایز مربوط باشد. کوچکترین نانوذرات و نانومیله‌ها احتمالا سلول‌های باکتریایی را درونی می‌کنند، درحالی‌که اندازه ذرات ZnO در مقیاس میکرو، مانند چهارشاخه‌ها و ساختارهای ناهمگن می‌توانند از طریق انتشار یونی و تولید رادیکال‌های آزاد، با دیواره‌های سلولی تعامل داشته باشند و بیشتر وارد سلول‌ها شوند و اجزای سلولی مانند DNA، پروتئین‌ها و لیپیدها را از بین ببرند.
نتایج ما نشان‌دهنده افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال بین سلولی (ROS) در سلول‌های باکتری اورئوس نهفته شده با اندازه ذرات ZnOدر مقیاس نانو، NRs و HSs است که به شدت با فعالیت آنتی‌باکتریال آن‌ها مرتبط است. جالب توجه است که افزایش ROS بین سلولی در اشریشیاکلی برای سلول‌های کمتری با ساختارهای ناهمگن مشاهده شد. که این امر می‌تواند مربوط به سد بیولوژیکی نانوذرات برای عبور از دیواره سلولی اشریشیاکلی باشد.
از سوی دیگر، یون‌های Zn+2 می‌توانند به راحتی از طریق دیواره‌های سلولی باکتری‌های گرم منفی با بار منفی نفوذ کنند. به‌طورکلی تصور می‌شود که باکتری‌های گرم منفی بیشتر از گرم مثبت در برابر حمله عوامل خارجی، مانند نانوذرات فلزی، نانوذرات نقره و طلا، حساس هستند. دلیل اصلی تفاوت در حساسیت و مقاومت باکتریایی، ترکیب دیواره سلولی باکتری است.
تایل و همکارانش بیان کردند که اشرشیاکلی گرم منفی نسبت به اورئوس گرم مثبت نسبت به ذرات ZnO حساسیت کمتری داشته و مهار باکتری‌های گرم منفی به غلظت‌های بالاتری از اندازه ذرات ZnO در مقیاس نانو نیاز دارد.